小鼠肝微粒體是體外藥物代謝、酶活性研究的核心生物材料，其活性穩(wěn)定性直接決定實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性。以下是肝微粒體活性測(cè)定的關(guān)鍵方法和標(biāo)準(zhǔn)化保存流程，步驟清晰、可操作性強(qiáng)。
 

　　一、 小鼠肝微粒體活性測(cè)定(以 CYP450 酶活性為例)
 

　　CYP450 酶是肝微粒體中負(fù)責(zé)藥物代謝的核心酶系，常用對(duì)硝基苯甲醚(PNOD)脫甲基反應(yīng)測(cè)定 CYP1A2 活性，作為肝微粒體活性評(píng)價(jià)的指標(biāo)。
 

　　1. 試劑與耗材準(zhǔn)備
 

　　緩沖液：0.1mol/L 磷酸鉀緩沖液(pH 7.4)、10mmol/L PNOD 底物溶液(甲醇溶解)、10mmol/L NADPH 再生系統(tǒng)(含 NADPH、葡萄糖 - 6 - 磷酸、葡萄糖 - 6 - 磷酸脫氫酶)
 

　　器材：低溫離心機(jī)、酶標(biāo)儀、恒溫水浴鍋、EP 管、移液槍
 

　　2. 活性測(cè)定操作步驟
 

　　反應(yīng)體系配制(總體積 200μL，冰上操作)


 

　　空白對(duì)照組：用緩沖液替代肝微粒體蛋白液。
 

　　孵育反應(yīng)
 

　　37℃恒溫水浴孵育 30min，精準(zhǔn)控制時(shí)間。
 

　　加入 50μL 1mol/L 鹽酸終止反應(yīng)。
 

　　產(chǎn)物檢測(cè)
 

　　加入 150μL 1mol/L 氫氧化鈉溶液，振蕩混勻，室溫靜置 10min。
 

　　酶標(biāo)儀 405nm 波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度值(OD 值)，根據(jù)對(duì)硝基苯酚標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算產(chǎn)物生成量。
 

　　活性計(jì)算
 

　　酶活性單位定義：每分鐘生成 1nmol 對(duì)硝基苯酚所需的酶量為 1 個(gè)活性單位(U)。
 

　　公式：酶活性(U/mg 蛋白)= 產(chǎn)物生成量(nmol)÷ 孵育時(shí)間(min)÷ 蛋白濃度(mg/mL)
 

　　3. 其他活性指標(biāo)測(cè)定
 

　　葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶(UGT)活性：以 4 - 甲基傘形酮為底物，測(cè)定熒光產(chǎn)物生成量。
 

　　谷胱甘肽 S - 轉(zhuǎn)移酶(GST)活性：以 1 - 氯 - 2,4 - 二硝基苯為底物，檢測(cè) 340nm 處吸光度變化。
 

　　二、 小鼠肝微粒體的保存方法
 

　　肝微粒體易失活，需嚴(yán)格控制保存條件，核心原則是低溫、避光、防反復(fù)凍融。
 

　　1. 短期保存(≤7 天)
 

　　新鮮制備的肝微粒體蛋白液，用磷酸鉀緩沖液調(diào)整蛋白濃度至 10-20mg/mL。
 

　　分裝為 50-100μL / 管(避免反復(fù)凍融)，置于 **-20℃冰箱 ** 保存。
 

　　適用場(chǎng)景：短期內(nèi)需完成的實(shí)驗(yàn)，保存期間活性會(huì)緩慢下降，建議 7 天內(nèi)用完。
 

　　2. 長(zhǎng)期保存(數(shù)月至數(shù)年)
 

　　添加保護(hù)劑：在肝微粒體蛋白液中加入終濃度 10%-20% 的甘油(分析純)，充分混勻，甘油可降低冰點(diǎn)，保護(hù)酶結(jié)構(gòu)。
 

　　分裝凍存：按單次實(shí)驗(yàn)用量分裝至無(wú)菌 EP 管，管內(nèi)避免留氣泡，密封管口。
 

　　梯度降溫凍存
 

　　先置于 4℃冰箱 30min，再轉(zhuǎn)移至 - 80℃超低溫冰箱，避免溫度驟降導(dǎo)致蛋白變性。
 

　　有條件的可使用程序降溫盒，降溫速率控制在 - 1℃/min，凍存效果更佳。
 

　　液氮保存：若需保存數(shù)年，可將分裝后的肝微粒體轉(zhuǎn)移至液氮罐(-196℃)，酶活性幾乎無(wú)損失，適合珍貴樣品。
 

　　3. 凍存后復(fù)蘇與使用要點(diǎn)
 

　　復(fù)蘇：從低溫冰箱取出后，立即置于 37℃水浴鍋中快速解凍，輕輕顛倒混勻，避免劇烈振蕩。
 

　　解凍后處理：解凍后的肝微粒體需在冰上放置，1h 內(nèi)完成實(shí)驗(yàn)；嚴(yán)禁反復(fù)凍融，否則酶活性會(huì)急劇下降(凍融 1 次活性損失可達(dá) 30% 以上)。
 

　　活性驗(yàn)證：長(zhǎng)期保存的肝微粒體，使用前需重新測(cè)定酶活性，確?；钚詽M足實(shí)驗(yàn)要求。
 

　　三、 注意事項(xiàng)
 

　　活性測(cè)定全程需冰上操作，防止肝微粒體在室溫下失活。
 

　　蛋白濃度測(cè)定建議用 BCA 法，避免考馬斯亮藍(lán)法對(duì)酶活性的干擾。
 

　　保存時(shí)需在管身標(biāo)注制備日期、蛋白濃度、活性值，便于后續(xù)取用。
 

　　長(zhǎng)期保存的肝微粒體，應(yīng)避免頻繁開(kāi)關(guān)冰箱門(mén)，減少溫度波動(dòng)。